Xu Pengpeng, Li Linzi , Wang Guizhen, Yin Haibo, Li Renqiang
(Department of Biotechnology, Jinan University, Guangzhou 510632, China)
Abstract Sepharose CL-6B was used as an affinity chromatography column to purify and analyze the lectin in ginkgo biloba seeds. Coagulation experiment and comparison with those lectins present in ricinus and in seeds of bitter gourd explained that lectin in ginkgo biloba seeds was a protein with only one subunit, which was similar to the galactose-specific recognition B chain in ricinus. The method adopted in this study is available for purifying the lectins from different plants.
银杏果凝集素的纯化与分析
徐朋朋 李琳子 王桂珍 殷海波 李任强
（暨南大学生物工程学系，广东广州 510632）
摘要 利用层析填料Sepharose CL-6B含有大量b-半乳糖苷键配基的化学特性，直接以其亲和层析分离纯化并分析银杏果中的凝集素。通过凝血实验和与蓖麻、苦瓜中的凝集素进行比较，证明银杏果中的半乳凝集素是一个单亚基蛋白，它与蓖麻中特异性结合半乳糖的B链相似。本实验采用的方法操作简单且效果好，也可应用于从不同植物中提取纯化凝集素。
关键词 银杏果；凝集素；纯化与分析
银杏果具有很好的保健、药用价值，但也有一定的毒性，同时，其提取物具有凝集红细胞的作用，说明其中含有凝集素。
凝集素是一类糖结合蛋白，广泛存在于动植物等生物界中。植物凝集素是一组具有高度特异性糖结合活性的蛋白，在植物自我保护中起一定的作用[1]，对细胞有毒害作用。近年来，对植物凝集素的研究越来越深入，发现其在生物体中起到相当重要的生理作用[2]。银杏果中的凝集素可能是银杏果表现药理功效的成分之一。本研究根据植物凝集素的性质，利用层析填料琼脂糖凝胶CL-6B含有大量β-半乳糖苷键配基的化学特性，直接以其亲和层析分离纯化并分析银杏果中的凝集素，并与蓖麻、苦瓜中的凝集素进行比较。
1 实验
1.1试剂与仪器
银杏，蓖麻，苦瓜购于市场。Sepharose CL-6B填料购于鼎国生物公司；实验用兔（用于提取红细胞）购于我校动物中心；层析柱管(22 cm ×1.5 cm, Millipore, 内填Sepharose CL-6B填料；40 cm ×1.5 cm, Millipore)，HD-2001-B-C型核酸蛋白检测仪(上海嘉鹏科技有限公司)，FR-980型生物电泳图像分析系统(上海复日科技有限公司)；真空冷冻干燥器(Heto)；低温高速离心机( Thermo Election Corporation )；电泳系统由Power Pac HV电泳仪和Mini-Protean 3电泳槽组成(Bio-Rad )；其他各种试剂或药品购于广州化学药品公司，均为分析纯。
1.2 实验方法
1.2.1 样品粗提液的制备
将预冷的磷酸缓冲液(0.01 mol/L, pH 7.2, 含有 0.15 mol/L NaCl)与银杏果混合后用高速搅拌机破碎，匀浆液在室温下缓慢搅拌30分钟，4°C抽提过夜。离心(4°C, 10000 rpm，30 min)，在上清液中缓慢加入硫酸铵至20%饱和度，离心去沉淀，上清中继续加硫酸铵至80%饱和度，4°C静置过夜。离心（4°C, 10,000 rpm ，30 min）收集沉淀并用少量的磷酸缓冲液(0.01 mol/L, pH 7.2)溶解，然后对相同的缓冲液透析，再离心去除沉淀。
制备蓖麻样品粗提液的方法和白果基本相同，但不用分级盐析，直接加硫酸铵至60%饱和度，离心，收集沉淀。
苦瓜样品粗提液的制备方法也和银杏基本相似，只是缓冲液采用的是Tris–HCl–Ca2+缓冲液 (0.01 mol/L Tris, 0.15 mol/L NaCl, 2.0 mmol/L CaCl2; pH 7.4)，也采用分级盐析沉淀法，首先加硫酸铵至20%饱和度，离心，上清中继续加硫酸铵至60%饱和度，收集沉淀。
1.2.2 亲和层析
Sepharose CL-6B亲和层析柱用平衡液充分平衡后， 以0.50 ml/min速度上样。蓖麻和银杏果样品采用的平衡液是0.01 mol/L, pH 7.2的磷酸缓冲液，苦瓜样品用的是Tris–HCl–Ca2+缓冲液(0.01 mol/L Tris, 0.15 mol/L NaCl, 2.0 mmol/L CaCl2; pH 7.4)。蓖麻和苦瓜的洗脱液，是在它们的平衡液中分别加0.2 mol/L的半乳糖，银杏果的洗脱液是在它的平衡液中加0.25 mol/L的NaCl。各样品大部分蛋白质不被柱子吸附。收集由洗脱液洗脱下来的蛋白质。
1.2.3 凝血实验
经亲和层析洗脱的蛋白，用真空冷冻干燥机(Heto, High Technology of Scandinavia, Denmark)浓缩，以水透析去除半乳糖和盐，做凝血实验和凝胶电泳（SDS-PAGE）。凝血实验测试组含25μl样品蛋白、50μl的2%红细胞悬液和25μl磷酸缓冲液(0.01 mol/L ，0.15 mol/L NaCl, pH 7.2)，室温下静置2h。在对照组中，用生理盐水取代样品蛋白，其它条件一样。还有一对照组，测试组中加25μl含有0.20 mol/L半乳糖的磷酸缓冲液。
1.2.4 SDS-PAGE
蛋白样品溶液与相同体积的1% SDS溶液（加或不加巯基乙醇）混合作为SDS-PAGE样品。所用分离胶浓度为12%。用电泳图谱分析系统（FR-980，上海复日科技有限公司）分析SDS-PAGE结果。
2 结果与讨论
2.1 Sepharose CL-6B亲和层析柱的分离作用
图1是银杏果粗制蛋白液在Sepharose CL-6B亲和层析柱的分离效果。大部分蛋白都不被柱子吸附（大峰），但仍有少量蛋白能与配基半乳糖苷键作用而被吸附（小峰），这部分蛋白可以被认为是半乳糖结合蛋白，即凝集素。蓖麻、苦瓜的分离图谱与银杏果的相似，不再列出。
图1 银杏果样品液在Sepharose CL-6B柱上的洗脱峰
大峰是没有被柱子吸附的蛋白（穿透峰），小峰是被洗脱液洗脱的蛋白。
2.2 凝血效应
图2为由Sepharose CL-6B亲和层析柱纯化的银杏蛋白的凝集血细胞的实验结果，苦瓜、蓖麻子蛋白也有相似的结果（图未列出）。这些蛋白具有凝血效应（图中的A 和 A’），是凝集素，但它们的凝血活性可被半乳糖减弱或抑制（图中的B 和 B’）。
| A | A’ |
| B | B’ |
| C | C’ |
图2 由Sepharose CL-6B亲和层析柱提取的银杏果蛋白的血细胞凝集作用
A, A’: 测试组； B, B’: 含有半乳糖的对照组；C, C’: 对照组。 A, B, C 是用显微镜照相 (10×10)； A’, B’, C’ 是用肉眼观察的照相。
2.3 SDS-PAGE结果
图3为蓖麻凝集素的SDS-PAGE图谱。在非还原态的SDS-PAGE（不经巯基乙醇处理）中，蓖麻凝集素显示两条分子量非常接近的电泳带，与标准（Marker）对比，它们的分子量约为63 kDa。在还原态SDS-PAGE（经巯基乙醇处理）中，显示3条电泳带，它们的分子量在32-36 kDa之间。这些结果，即有2个63 kDa左右的蛋白质以及有数个分子量在32-36kDa之间的亚基，与早期的报道是相符的[3-5]。图4显示了苦瓜凝集素的SDS-PAGE图谱，其只有一条纯的凝集素蛋白带，分子量约为120 kDa，由4个分子量在32-36 kDa之间的亚基组成，这与早期关于苦瓜子半乳糖特异性凝集素的报道完全相符[6，7]。这些结果，连同凝血实验的结果都证明了用Sepharose CL-6B作为亲和层析柱来提取凝集素是可行的。
图3 Sepharose CL-6B柱吸附的蓖麻蛋白的SDS-PAGE图谱
左边：未经巯基乙醇处理，泳道1：Marker; 泳道2：洗脱蛋白
右边： 经巯基乙醇处理，泳道1：Marker; 泳道2：洗脱蛋白; 泳道3和泳道4：Sepharose CL-6B柱的穿透峰
图4 Sepharose CL-6B柱吸附的苦瓜蛋白的SDS-PAGE图谱
左边：经巯基乙醇处理，泳道1：粗制样品液; 泳道2：Marker; 泳道3：洗脱蛋白; 泳道4：SepharoseCL-6B柱的穿透峰
右边：未经巯基乙醇处理，泳道5：洗脱蛋白; 泳道6：Marker
图5显示了银杏果凝集素的SDS-PAGE图谱。不管用或不用巯基乙醇处理，蛋白样品的电泳结果都是相同的只有2条带。为了分析此2个蛋白，将其与蓖麻、苦瓜子的凝集素一起做了还原性的SDS-PAGE，结果如图6。显然，3种凝集素中都存在一条分子量约为33 kDa的多肽（用箭头标记），此可认为是半乳糖特异性识别的B链。银杏果蛋白中分子量小于30 kDa的那条多肽可以认为不是凝集素的一个亚基，因为它的含量与另一条多肽比起来，实在是太低。所以，银杏果中的半乳凝素应该是一个单亚基蛋白，它与蓖麻中与半乳糖特异性结合的B链是相似的，因为它也有半乳糖结合特性。另一个分子量小于30 kDa的多肽是一个独立的半乳糖结合蛋白。
图5 Sepharose CL-6B柱吸附的银杏果蛋白的SDS-PAGE图谱
泳道1：未经巯基乙醇处理; 泳道2：经过巯基乙醇处理; 泳道M：Marker
图6 Sepharose CL-6B柱吸附的银杏果、苦瓜、蓖麻蛋白的SDS-PAGE图谱
1：蓖麻半乳凝素; 2：银杏果半乳凝素; 3：苦瓜半乳凝素; M：Marker
2.4 讨论
实验说明，利用Sepharose CL-6B，通过一步简单的亲和层析可以纯化出银杏果凝集素，且效果好，操作简单。当然，此方法也可应用于从不同植物中提取纯化凝集素。
当与苦瓜子和蓖麻子中的凝集素相比较，银杏果凝集素蛋白是单亚基而苦瓜子和蓖麻子的凝集素都是多亚基，但三者都有一个分子量约为33 kDa的亚基—半乳糖特异性识别的B链。因此，可认为半乳糖特异性识别的B链是一古老的蛋白，植物中的半乳糖特异性结合凝集素可能都是以它为基础发展起来的，这也说明银杏是古老的植物之一。另外，分析银杏果凝集素得出，可能古老植物中的蛋白质结构相对简单，随着物种的进化，功能蛋白质的结构也由简单向复杂进化。
虽然本研究证明了银杏果凝集素的分子组成相对简单，能解释银杏果提取物具有凝集效果的原因，但由于中草药药理作用与其所含凝集素的关系有许多还不清楚，所以银杏果凝集素与其药理作用的关系还有待深入研究，本实验为进一步开展研究打下了基础。