Li Zhengping*, Lv Xuechong, Han Jun Wang, Lei
(College of Chemistry and Environmental Science, Hebei University, Baoding 071002)
Abstract Pyrophosphate acid (PPi)can complex unstable Mn(III)ion in acidic medium to form([Mn（H2P2O7）3]3-), which can react with luminol to produce strong chemiluminescence(CL). Based on this, a simple and economical method foe sensitive determination of PPi has been established and successfully applied to determine pyrophosphate acid in real sample．There is a good linear relationship between CL intensity (ICL) and PPi concentration in the range of 5.0×10-7 mol/L～1.0×10-5 mol/L；The correlation regression equation is ICL=7.55+7.61C (×10-7 mol/L)，with a correlation coefficient r=0.9984; The corresponding detection limit(3s ,n=11)is 2.0×10-5 mol/L．
焦磷酸络锰(Ⅲ)氧化鲁米诺化学发光法测定焦磷酸
李正平* 吕学冲 韩军 王磊
（河北大学化学与环境科学学院，保定 071002）
摘要 在酸性条件下，焦磷酸（PPi）能络合不稳定的锰（Ⅲ）离子，形成焦磷酸络锰（Ⅲ）[Mn（H2P2O7）3]3-，此络合物能氧化鲁米诺产生强烈的化学发光。基于此，本文建立了一种操作简便、经济实用检测焦磷酸的分析方法，并成功应用于样品中焦磷酸的测定。其线性范围为5.0×10-7 mol/L～1.0×10-5 mol/L，线性回归方程ICL=7.55+7.61C（×10-7 mol/L），相关系数r＝0.9984，检出限（3s ，n=11）为2.0×10-7 mol/L。
关键词 化学发光，焦磷酸络锰（Ⅲ），焦磷酸
1 引言
焦磷酸是生物体内多种生化代谢反应的中间产物，在生命过程中具有重要的作用，包括参与细胞内钙离子的转运[1,2]、核苷酸的运输[3]、调节酶的活性[4]。在DNA合成过程中，DNA链每延伸一个碱基，就产生一个焦磷酸分子，由此焦磷酸的分析测定也用于DNA的测序及DNA突变分析[5]。在日常生活中，焦磷酸主要用作软水剂、锅炉除垢剂、合成洗涤剂的添加剂、染料、油墨和钻井泥浆的分散剂，焦磷酸也用于金属表面处理及食品添加剂等。因此对于焦磷酸的分析具有重要的意义。
目前，检测焦磷酸主要采用分光光度法[6,7]、重量分析法[8]、萤火虫素生物发光法[9]等。分光光度法和重量分析法灵敏度低；生物发光法需要将焦磷酸转化为三磷酸腺苷（ATP），试剂昂贵、操作复杂。高锰酸钾和硫酸锰在酸性条件下生成锰（Ⅲ），锰（Ⅲ）可氧化鲁米诺产生化学发光（CL）[10]，但锰（Ⅲ）不稳定，在溶液中很快歧化生成锰（Ⅱ）和二氧化锰。我们发现不稳定的锰（Ⅲ）可与焦磷酸形成稳定的络合物并能氧化鲁米诺产生强烈的化学发光信号，由此建立了一种操作简便、经济实用的分析焦磷酸的新方法。该方法具有较高的灵敏度和选择性，对于研究生物代谢反应、DNA测序及日用品中焦磷酸的测定都具有重要的意义。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
BPCL微弱化学发光测定仪（中国科学院生物物理研究所）；SX-4-10型马福炉（北京中兴伟业仪器有限公司）；AUX220电子天平（日本岛津公司）。
鲁米诺（陕西师范大学合成）；硫酸锰（北京化学试剂三厂）；高锰酸钾（北京化学试剂三厂）；焦磷酸钠（Sigma公司）；用0.1 mol/L的氢氧化钠溶液配制2.5×10-2 mol/L的鲁米诺储备液；Na2CO3-NaHCO3（pH=11，浓度为0.16 mol/L）缓冲溶液稀释鲁米诺储备液至5.0×10-4 mol/L，作为工作液。实验所用试剂为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。
2.2 实验方法
在1.5 mL塑料离心管中加入0.3 mL一定浓度的焦磷酸钠溶液或样品溶液，边振荡边加入0.08 mL 1.0×10-3 mol/L的硫酸锰溶液和0.02 mL 1.0×10-3 mol/L的高锰酸钾溶液，再加入0.4 mL 0.2 mol/L的HCl，静置反应50 min。取0.1 mL此反应溶液加入反应池中，再将反应池放入BPCL微弱化学发光测定仪中，最后用可调定量加样器注入0.2 mL的 5.0×10-4 mol/L鲁米诺工作液，检测化学发光。
3 结果与讨论
3.1 化学发光强度-时间曲线
在酸性条件下，高锰酸钾和硫酸锰反应生成不稳定的锰（Ⅲ），焦磷酸络合锰（Ⅲ）形成稳定的络合物并氧化鲁米诺发光，反应式如下：
4Mn2++MnO4–+8H+=5Mn3++4H2O；Mn3++3P2O74-+6H+=[Mn（H2P2O7）3]3-
图1是鲁米诺-焦磷酸络锰（Ⅲ）体系化学发光的强度-时间曲线。由图1可看出，焦磷酸存在时，该体系能产生强的化学发光信号。从反应开始到发光强度达到最大值所需时间约为0.15 S，并很快衰减，知此体系为快发光体系。本文以发光信号的峰高来定量测定焦磷酸。
3.2 反应时间的影响
考察了10～60 min范围内，高锰酸钾和硫酸锰反应时间对化学发光强度的影响。如图2所示，体系刚开始反应时，有高锰酸钾存在于反应体系中，高锰酸钾本身能够氧化鲁米诺发出很强的光，所以空白和样品的信号都很高；随着反应的进行，高锰酸钾氧化硫酸锰生成锰（Ⅲ）离子，在没有焦磷酸的情况下，锰（Ⅲ）离子会歧化分解为二氧化锰和锰（Ⅱ），只产生较低的CL强度（图2b）。在有焦磷酸存在时，焦磷酸会络合不稳定的锰（Ⅲ）生成稳定的焦磷酸络锰（Ⅲ）并能氧化鲁米诺产生强烈的化学发光信号（图2a）。该反应在50 min后，空白和样品的CL都趋于稳定，因此选择反应时间为50 min。
图1 化学发光强度-时间曲线
Fig. 1 Chemiluminescence intensity-time profile
manganese sulfate, 1.0×10-4 mol/L; potassium
permanganate, 2.5×10-5 mol/L; HCl, 0.2 mol/L;
sodium pyrophosphate, 5.0×10-6 mol/L;
luminol, 5.0×10-4 mol/L ; reaction time, 50 min
图2 反应时间对化学发光强度的影响
Fig.2 Influence of reaction time on the CL intensity. sodium pyrophosphate, (a)5.0×10-6 mol/L; (b) 0 mol/L
manganese sulfate, 1.0×10-4 mol/L; potassium permanganate, 2.5×10-5 mol/L; HCl, 0.2 mol/L; sodium pyrophosphate, 5.0×10-6 mol/L; luminol, 5.0×10-4 mol/L
3.3 盐酸浓度的影响
锰（Ⅲ）/锰（Ⅱ）在酸性溶液中（298 K）的标准电极电势为1.5415 V，说明锰（Ⅲ）在酸性环境下有较强的氧化性，可氧化鲁米诺产生较强的化学发光；而在碱性环境下，锰（Ⅲ）会以金属氧化物的形态沉淀或吸附在反应器皿壁上，从而失去氧化能力，故本实验的反应环境选择为酸性。
实验考察了0.01 mol/L～1.00 mol/L的盐酸对反应体系的影响。如图3所示，在0.2 mol/L HCl时，焦磷酸产生的CL信号与空白值相差最大，且有最大的信号/空白比，故本文选择0.2 mol/L HCl为该体系的最佳酸度条件。
3.4 线性范围、精密度和检出限
在以上所选的最佳条件下，硫酸锰-高锰酸钾-焦磷酸钠-鲁米诺体系的化学发光强度（ICL）和焦磷酸钠的浓度（C）在5.0×10-7 mol/L～1.0×10-5 mol/L的范围内具有良好的线性关系，如图4所示。回归方程为ICL =7.55+7.61C （×10-7 mol/L），线性相关系数为r=0.9984，检出限（3s ，n=11）为2.0×10-7 mol/L，应用该方法平行测定了11份焦磷酸钠浓度为5×10-6 mol/L的溶液，所得结果的相对标准偏差（RSD）为4.7%。
图3 盐酸浓度对化学发光强度的影响
Fig.3 Effect of HCl concentration on the CL intensity sodium. pyrophosphate,
(a)5.0×10-6 mol/L ; (b) 0 mol/L manganese sulfate, 1.0×10-4 mol/L; potassium permanganate, 2.5×10-5 mol/L; sodium pyrophosphate, 5.0×10-6 mol/L; luminol, 5.0×10-4 mol/L; reaction time, 50 min.
图4 工作曲线
Fig. 4 Work curve
manganese sulfate, 1.0×10-4 mol/L; potassium
permanganate, 2.5×10-5 mol/L; HCl, 0.2 mol/L;
luminol, 5.0×10-4 mol/L; reaction time, 50 min.
3.5 干扰实验
考察了共存物质对5.0×10-6 mol/L焦磷酸测定的影响，当相对误差在±5%左右时：100,000倍量的Ca2+，1000倍量的Al3+、Mg2+，10倍量的PO43-、SiO32-无干扰。
3.6 样品的分析
准确称取9.6410 g牙膏，烘干后放入马福炉在800 ℃的条件下灰化5 min，最后得3.7010 g的灰白色固体（牙膏灰）。称取0.0100 g牙膏灰溶于10 mL 0.2 mol/L的盐酸，形成的溶液澄清无残渣。最后用0.1 mol/L的氢氧化钠溶液调节溶液pH值至中性，测定其焦磷酸含量，结果如表1所示，测定结果的精密度和加标回收率令人满意。
表1 样品中焦磷酸的测定
Table 1 Detection results of pyrophosphate in sample
| 样品 Sample |
测得量 Found （10-6 mol/L） |
加入量 Added （10-6 mol/L） |
测的总量 Total Found （10-6 mol/L） |
RSD（%） n=5 |
回收率（%） Recovery |
| 牙膏 | 1.88 | 1.0 | 2.91 | 4.3 | 103 |
| Toothpaste | 1.88 | 2.0 | 3.84 | 3.1 | 97.8 |